杂交瘤技术自 Köhler 与 Milstein 于 1975 年首次提出以来，已成为获取单克隆抗体的经典平台技术之一。该方法通过融合免疫活化的 B 细胞与骨髓瘤细胞，获得能够稳定分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株，是目前最为成熟的抗体开发策略之一。本文从技术流程角度出发，系统介绍杂交瘤构建、克隆筛选及抗体表达纯化的关键环节。
一、杂交瘤构建：融合细胞的形成与筛选
杂交瘤构建的起始环节为抗原免疫，常选用 BALB/c 小鼠作为实验模型。免疫方案根据抗原类型、免疫原性及预期应用需求进行定制化设计，常规免疫周期为 6～8 周。免疫结束后采集脾细胞，与不分泌抗体但具永生性的骨髓瘤细胞（如 SP2/0 或 NS0）进行细胞融合，通常采用聚乙二醇（PEG）法或电融合法。
融合后细胞接种于含 HAT 的选择性培养基中，去除未融合及单侧融合细胞，获得初代融合细胞群体。融合效率与细胞活性、比例、融合方式等因素密切相关，需依据项目特点进行动态调整。
二、单克隆抗体筛选与克隆稳定化
融合后的细胞群体具有多克隆性质，需通过功能筛选获得目标特异性克隆。常用筛选手段包括间接 ELISA、细胞结合实验、Western blot 等，部分项目可结合流式细胞术或表面等离子共振（SPR）进行高亲和力筛查。
展开剩余63%筛选阳性的克隆需经亚克隆操作（常用有限稀释法或单细胞分选），以实现单克隆化与稳定表达。克隆稳定性评估通常包括多代培养后抗体滴度一致性、染色体核型检测及转录水平分析。
三、杂交瘤细胞扩增与抗体表达系统
筛选出的稳定杂交瘤细胞可用于体外小规模或中等规模抗体表达，适用于科研级抗体制备。对于对产量或结构修饰有更高要求的项目，可转入CHO 或 HEK293 表达系统进行重组抗体表达，以提升产量并保证翻译后修饰一致性。
在此阶段，抗体表达水平、糖基化特征、聚集状态及功能活性等均需进行系统性分析，以评估下游可用性。
四、抗体纯化与质量分析
抗体纯化通常采用蛋白 A 或蛋白 G 亲和层析，后续根据纯度需求进行离子交换或凝胶过滤等精细纯化步骤。对于某些特异性较差的抗体，可能需结合亲和抗原柱进行特异性富集。
纯化后的抗体应进行标准化质控检测，包括：
SDS-PAGE 和 SEC-HPLC 评估纯度与聚集
ELISA 评估结合活性
Endotoxin 检测确认内毒素水平
可选项目：等电点分析、糖型分析等
这些数据对确保抗体的可重复使用性及跨批次一致性具有关键意义。
五、抗体定制能力与高难度项目的技术应对
对于常规抗体开发以外的需求，例如：
非免疫原性抗原
高同源性家族蛋白区分
特定构象依赖性抗体筛选
跨物种反应抗体开发
均可通过优化免疫杂交瘤策略（如抗原修饰、载体辅助免疫、佐剂改良等），并结合高通量筛选平台进行解决。部分项目可与人源化、亲和力成熟、重组表达等技术联合实施，形成整合式抗体开发解决方案。
杂交瘤服务作为抗体开发的核心支撑技术，其流程虽已标准化，但在特异性抗体的获得、稳定细胞株构建、表达体系选择及纯化策略上仍存在大量技术细节可优化。站在科研人员角度，精准设计免疫方案、严谨执行筛选流程、规范建立表达体系，是确保抗体项目成功的基础。
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